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                    实验资料 首页 > 实验资料 > 细胞培养常见问题及其解决方法
                    细胞培养常见问题及其解决方法
                    合肥博美生物科技有限责任公司 / 2015-03-02

                     

                                                                                                             细胞培养常见问题及其解决方法
                     
                    1.如何选用特殊细胞系培养基? 
                    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 
                    2. ?#38382;?#39035;更换培养基? 
                    视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按?#22791;?#25442;培养基即可。  
                    3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基? 
                    不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之
                    细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。 
                    4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类? 
                    不能。血清是
                    细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。  
                    5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?  
                    FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。  
                    6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?  
                    一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系?#24120;?nbsp;而培养基中NaHCO3 的含量将决定
                    细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。 
                    7.Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本?#23454;?#21151;能差别?  
                    HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在
                    细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。 
                    8. 细胞之接?#32622;芏任?#20309;?  
                    依照细胞株基本数据上之接?#32622;?#24230;或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
                    9. 悬浮性细胞应如何继代处理?  
                    一般仅需?#20013;?#21152;入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至?#23454;?#27987;度, 重复前述步骤即可。 
                    10.冷冻管应如何解?#24120;?nbsp; 
                    取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解?#24120;?nbsp;轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆?#36873;?nbsp;
                    11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?  
                    除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应?#33519;?#25918;入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 
                    12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如?#26410;?#29702;?  
                    一般使用之trypsin-EDTA 浓?#20219;?.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。  
                    13.欲将一般动物细胞离?#21335;?#26469;,其离心速率应为多少转速?  
                    欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分?#27185;?nbsp;过高之转速, 将造成细胞死亡。  
                    14. 细胞冷冻培养基之成份为何?  
                    动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均?#28982;?#21512;之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO ?#33519;?#21152;入细胞液中, 必须使用前先?#20449;?#21046;完成。  
                    15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?  
                    冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌?#32431;觶?nbsp;第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而?#32479;?#26377;害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质?#22235;ぁ?nbsp; 
                    16.冷冻保存细胞之方法?  
                    冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 
                    冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大?#20811;?#20129;,亦?#21830;?#36807;此步骤?#33519;?#25918;入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。  
                    17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?  
                    冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
                    18.培养基中是否须添加抗生素?  
                    除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。 
                    19.应如何避免细胞污染?  
                    细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作?#19968;?#22659;不?#36873;?#27745;染之血清和污染之细胞?#21462;Q细?#20043;无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来?#26149;?#22521;养基配制是减低污染之最好方法。  
                    20.如果细胞发生微生物污染时,应如?#26410;?#29702;?  
                    原则上:?#33519;用?#33740;后丢弃之。  
                    当重要的培养污染时,研?#31354;?#21487;能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵?#31119;盐?#26579;细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒?#26009;?#27602;培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。 
                    高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂?#20811;?#24179;。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。?#26053;?#26159;推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 
                    1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。 
                    2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。 
                    3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合?#35748;陆?#21644;变?#30149;?nbsp;
                    4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。 
                    5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 
                    6.重?#24202;?#39588;4。 
                    7.在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。 
                    21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?  
                    不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。  
                    22.支原体污?#20928;?#23545;细胞培养有何影响?  
                    支原体污染几乎可影响所有细胞之生长?#38382;?nbsp;代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。 
                    23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如?#26410;?#29702;?  
                    ?#33519;用?#33740;后丢弃,以避免污染其它细胞株。
                    24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?  
                    定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。  
                    25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?  
                    培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色?#19981;?#38543;碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。  
                    26. 各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?  
                    不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响, 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。 
                    27. 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?  
                    研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误, 造成细胞的物理性损伤, 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔?#36141;?#20877;更换培养基即可。  
                    28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?  
                    研究人员在
                    细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不?#36873;?#34880;清使用错误或血清的品质不?#36873;?#35299;冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。  
                    29. 收到之冷冻管?#21487;?#30772;裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?  
                    冷冻管瓶盖裂纹,或?#21487;?#30772;裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一?#38395;?#32039;。  
                    30.L-谷氨酰胺在
                    细胞培养中重要吗?#20811;?#22312;溶液中不稳定吗?  
                    L-谷氨酰胺在
                    细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白?#23454;?#21512;成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过?#27426;问?#38388;后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。zzzzzz 
                    31.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?#31354;?#20010;二肽有多稳定?  
                    GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。 
                    GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分?#27185;珿lutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。 
                    32.什么培养基中可以省去加酚红?  
                    酚红在培养基中用作PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干?#20598;?#27979;,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。 
                    33.如何用台盼?#25216;?#25968;活细胞?  
                    用无血清培养基把细胞悬?#21512;?#37322;到200~2000个/毫升,在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而?#22659;?#34013;色细胞是死细胞。 
                    34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?  
                    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。 
                    35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?  
                    二价离子的?#33452;?#21046;胰蛋白酶活性。EDTA?#32654;?#34735;合游离的镁离子?#36879;?#31163;?#27185;?#20197;便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。 
                    36.室温下配制的Tris-HCl溶液,在37使用时PH值是多少?  
                    缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4,25,37时,不同PH值。 
                    50mM Tris-HC 溶液在4,25,37时,不同PH值 

                    4°C 
                    25°C 
                    37°C 
                    8.1
                    8.2
                    8.3
                    8.4
                    8.5
                    8.6
                    8.7
                    8.8
                    8.9
                    9.0
                    9.1
                    9.2
                    9.3
                    9.4
                    8.5
                    7.6
                    7.7
                    7.8
                    7.9
                    8.0
                    8.1
                    8.2
                    8.3
                    8.4
                    8.5
                    8.6
                    8.7
                    8.8
                    7.2
                    7.3
                    7.4
                    7.5
                    7.6
                    7.7
                    7.8
                    7.9
                    8.0
                    8.1
                    8.2
                    8.3
                    8.4
                    8.5


                    37.如?#26410;覶25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 
                    我们推荐使用脱落细胞的方法,此技术破坏性最小,生活力最高。通过使用巴斯德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。 
                    38.胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞: 
                    1. 去除培养基。 
                    2. 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS。 
                    3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰?#37238;?#30422;细胞表面)。 
                    4. 37 孵育5到10分钟。在仪器?#24405;?#27979;看到5分钟后它们正在向上移动。 
                    5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养?#21512;?#29942;壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。) 
                    6. 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。 
                    7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 
                    39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少? 
                    为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓?#20219;?0单位/毫升细胞悬液。 
                    40.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?#20811;?#30528;传代的?#38382;?#30340;增?#27185;?#23427;的感染能力会降低吗? 
                    通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候计数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间?#38470;擔?#23427;们的感染力将不在是有效的。 
                    41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,在放置几天后颜色变紫? 
                    这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口,在CO2培养箱孵育培养基10-15分?#27185;?#26469;校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体?#25442;唬?nbsp;
                    42. 
                    细胞培养基偶然?#27426;常?#21487;否继续使用? 
                    如果
                    细胞培养基偶然?#27426;常?#24744;应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。 
                    43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗? 
                    当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。
                    44. 培养基中添加?#25628;?#28165;和抗生素后,可长期保存吗? 
                    一旦您在新鲜培养基中添加?#25628;?#28165;和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基?#22659;?#20998;在解冻后就开始降解。 
                    45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗? 
                    大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果?#38382;?#26356;多都会在包含蛋白的溶液引起?#27426;?#27700;平的降解和沉淀,将会影响它的性能。 
                    46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 
                    胰蛋白酶在4就可能开始降解,如果在室温?#36335;?#32622;超过30分?#27185;?#23601;会变得不稳定。 
                    47.保存血清最好的方法? 
                    我们建议血清应保存在-5至-2O。若存放于4时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。 
                    48. 如何解冻血清才?#25442;?#20351;产品质量受损? 
                    将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均?#21462;?nbsp;
                    49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如?#26410;?#29702;? 
                    血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,?#19981;?#23384;在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。 
                    若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清?#26477;?#21487;接?#20598;?#20837;培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过?#22235;ぁ?/span>
                    50. 为什么要热灭活血清? 
                    加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞?#24405;碳?#24179;滑肌收?#37232;?#32454;胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。 
                    51. 有必要做热灭活吗? 
                    实验显示,经过正?#21453;?#29702;的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响?#25628;?#28165;的质量,而造成细胞生长速?#23454;?#38477;?#27712;?#32780;经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研?#31354;?#35823;以为是血清遭受污染,而把血清放在37环境中,又会使此沉淀物更增多,使研?#31354;?#35823;认为是微生物的分裂扩增。 
                    若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量! 
                    52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 
                    有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混?#24688;?#36825;应该?#25442;?#24433;响血清的质量。推荐在-20储存胎牛血清,避免反复冻融。 
                    53. 如何避免沉淀物的产生? 
                    我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作: 
                    (1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温),若血清解冻?#22791;?#21464;的温度太大(如-20至37),非常容易产生沉淀物。 
                    (2)解冻血清时,请随?#33519;?#20043;摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。 
                    (3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分?#19981;?#22240;此受到损害,而影响血清的质量。 
                    (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。 
                    (5)若必须做血清的热灭活,请遵守56,30分钟的原则,并且随时摇晃均?#21462;?#28201;度过高,时间过?#27809;?#25671;晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。
                                                细胞培养常见问题解答(FAQ)
                    1 冷冻管应如何解?#24120;?/span> 
                    取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解?#24120;?nbsp;轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆?#36873;?nbsp;
                    2 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO? 
                    除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应?#33519;?#25918;入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 
                    3 可否使用与原先培养条件不同之培养基? 
                    不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。 
                    4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类? 
                    不能。血清是
                    细胞培养上一个极为重要的营养来源, 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。 
                    5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? 
                    FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 
                    6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响? 
                    一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系?#24120;?nbsp;而培养基中NaHCO3 的含量将决定
                    细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。 
                    7 ?#38382;?#39035;更换培养基? 
                    视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按?#22791;?#25442;培养基即可。 
                    8 培养基中是否须添加抗生素? 除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。 
                    9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如?#26410;?#29702;? 
                    一般使用之trypsin-EDTA 浓?#20219;?.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。 
                    10 悬浮性细胞应如何继代处理? 
                    一般仅需?#20013;?#21152;入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至?#23454;?#27987;度, 重复前述步骤即可。 
                    11 欲将一般动物细胞离?#21335;?#26469;,其离心速率应为多少转速? 
                    欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分?#27185;?nbsp;过高之转速, 将造成细胞死亡。 
                    12 细胞之接?#32622;芏任?#20309;? 
                    依照细胞株基本数据上之接?#32622;?#24230;或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 
                    13 细胞冷冻培养基之成份为何? 
                    动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均?#28982;?#21512;之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO ?#33519;?#21152;入细胞液中, 必须使用前先?#20449;?#21046;完成。 
                    14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何? 
                    冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌?#32431;觶?nbsp;第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而?#32479;?#26377;害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质?#22235;ぁ?nbsp;
                    15 冷冻保存细胞之方法? 
                    冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 
                    冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大?#20811;?#20129;,亦?#21830;?#36807;此步骤?#33519;?#25918;入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 
                    降低一些。 
                    16 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度? 
                    冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 
                    17 应如何避免细胞污染? 
                    细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作?#19968;?#22659;不?#36873;?#27745;染之血清和污染之细胞?#21462;Q细?#20043;无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来?#26149;?#22521;养基配制是减低污染之最好方法。 
                    18 如果细胞发生微生物污染时,应如?#26410;?#29702;? 
                    ?#33519;用?#33740;后丢弃之。
                    19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状? 
                    不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 
                    无法以其外观分辨之。 
                    20 支原体污?#20928;?#23545;细胞培养有何影响? 
                    支原体污染几乎可影响所有细胞之生长?#38382;?nbsp;代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。 
                    21 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如?#26410;?#29702;? 
                    ?#33519;用?#33740;后丢弃,以避免污染其它细胞株。 
                    22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁? 
                    定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 
                    23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性? 
                    培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色?#19981;?#38543;碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。 
                    24 各种
                    细胞培养用的dish,flask是否均相同? 
                    不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响, 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。 
                    25 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形? 
                    研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误, 造成细胞的物理性损伤, 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔?#36141;?#20877;更换培养基即可。 
                    26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因? 
                    研究人员在
                    细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不?#36873;?#34880;清使用错误或血清的品质不?#36873;?#35299;冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。 
                    27 收到之冷冻管?#21487;?#30772;裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因? 
                    冷冻管瓶盖裂纹,或?#21487;?#30772;裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一?#38395;?#32039;。
                    细胞培养常见问题及解答 
                    4.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?#31354;?#20010;二肽有多稳定? 
                        GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。
                        GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分?#27185;珿lutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。
                    5.为什么培养基中可以省去加酚红? 
                        酚红在培养基中被?#32654;?#20316;为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干?#20598;?#27979;,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
                    6.如何用台盼?#25216;?#25968;活细胞? 
                        用无血清培养基把细胞悬?#21512;?#37322;到200-2000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而?#22659;?#34013;色的细胞是死细胞。
                    7.如何消除组织培养的污染?
                        当重要的培养污染时,研?#31354;?#21487;能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵?#31119;盐?#26579;细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒?#26009;?#27602;培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
                        高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂?#20811;?#24179;。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。?#26053;?#26159;推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
                    1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
                    2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
                    3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合?#35748;陆?#21644;变?#30149;?/span>
                    4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
                    5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
                    6)重?#24202;?#39588;4。
                    7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。
                    9.Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本?#23454;?#21151;能差别? 
                        HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。
                    10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什?#24202;?#21035;?
                        Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标?#25216;?#39564;程序,而?#39029;?#20102;这些标?#25216;?#27979;,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测:
                    End-Point Determination of Endotoxin Content
                    噬菌体检验
                    生物化学检测 
                    激素的检测
                    血红蛋?#20934;?#27979;
                    Sf9 细胞生长促进及方法学检测
                    11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么? 
                        二价离子的?#33452;?#21046;胰蛋白酶活性。EDTA?#32654;?#34735;合游离的镁离子?#36879;?#31163;?#27185;?#20197;便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
                    12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗? 
                        是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温?#36335;?#32946;15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下?#33519;?#21152;入。
                    13.我使用SF900 时,细胞生长良好,但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好? 
                        如果目的蛋?#36164;?#19968;个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。 
                    14.如何检测内毒素(热源)水平? 
                        LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系?#24120;?#19997;氨酸蛋白酶级联反应系?#24120;?#36890;过修饰凝集素,产生一种透明的胶,LAL中的凝固蛋白,从而,形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。
                    胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island,按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产?#26041;心?#27602;素检测前,用无热源的水1:10稀释样品。稀释样品沸水育5分?#27185;?#20197;消除抑制剂。(通常,血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程,使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。) 
                    15.我可以使用固体?#38382;?#30340;Murashige Skog 培养基吗? 
                        如果使用固体?#38382;?#30340;培养基,需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的?#33519;用?#33740;,应该高压灭菌琼脂溶液,然后把融化的琼脂溶?#26477;?#20837;到MS培养基中。
                    16. 20下配制的缓冲液,在?#32454;?#25110;?#31995;?#30340;温?#35748;翽H值会改变吗?
                        对于普通使用的缓冲液,PH值随温度变化而变化。
                    下表列出温度改变10时,PH值的变化情况
                    例如 20下配制PH7.4 Tris缓冲液,40时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78
                    17. 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37使用时PH值是多少?
                        缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4,25,37时,不同的PH值。
                    19. High Five细胞有任何其它名称吗?
                        High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
                    20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少? 
                        High Five无血清培养基中去污剂的浓度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。 
                    21.High Five细胞用多大的密度冻存? 
                        3.0x10E6 cells/ml 
                    22.在我的果蝇培养基中发?#20013;?#25104;白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗? 
                        可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6?#19969;?#37226;氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在?#26893;?#28201;度?#31995;?#30340;地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验?#25442;?#26377;不利的影响。 
                    23.如?#26410;覶25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 
                        我们强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性最小,生活力最高。通过使用巴氏德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。
                    胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:
                    1)去除培养基。
                    2) 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS.
                    3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰?#37238;?#30422;细胞表面)。
                    4) 37 孵育5到10分钟。在仪器?#24405;?#27979;看到5分钟后它们正在向上移动。
                    5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养?#21512;?#29942;壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)
                    6) 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。
                    7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 
                    24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少? 
                        为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓?#20219;?0单位/毫升细胞悬液。 
                    25.如何评估ES细胞?#32454;?#30340;胎牛血清? 
                        使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
                    相关生长效率分析:
                        当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中,检测开始和支持ES细胞克隆的能力。
                    细胞毒分析:
                        当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中,检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。
                    相关形态学和分化分析:
                        检测胎牛血清支持未分化ES细胞
                    克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红,分化的细胞较大,丰满,颜色较浅。
                        所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的,培养基中出现ESGRO会掩盖?#21830;?#29275;血清所导致的问题。(ESGRO或LIF经常?#32654;?#20445;持ES细胞处于未分化状态。)
                        经过培养发现,大约8批中有1批可以?#32654;?#22521;养ES细胞。
                    26.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?#20811;?#30528;传代的?#38382;?#30340;增?#27185;?#23427;的感染能力会降低吗? 
                        通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候记数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间?#38470;擔?#23427;们的感染力将不在是有效的。
                    趣味扑克玩法

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